Antonio Michele Ghislieri néven 1504. január 17-én született egy nemes, de szegény család gyermekeként Boscoban, a Milánói Nagyhercegségben (ma: Bosco Marengo, Piemont). Családja igyekezett a jövedelmezőnek ígérkező kereskedői pályára irányítani, de Antonio tizennégy évesen önszántából belépett a domonkosok közé, ekkor vette fel a Michele nevet is. A szerzetesrend Voghera melletti kolostorában kiváló neveltetésben részesült, és hamar elsajátította a domonkosok önmegtartóztató és puritán életvitelét. Később Vigevano majd Bologna domonkos kolostoraiban tanult, majd tanulmányai befejeztével 1528-ban pappá szentelték Genovában. Páviában tizenhat éven keresztül oktatta a rend novíciusait főként filozófiára és teológiára. Több domonkos kolostor vezetőjévé is megválasztották, ahol igyekezett megszilárdítani a Szent Domonkos által lefektetett erkölcsi fegyelmet és hitbéli buzgóságot. A domonkosok között hamar az egyik legismertebb szerzetessé vált, és többen példaképként tekintettek rá. Szerette a magányt, gyakran tartott penitenciát, éjszaka hosszú órákat töltött meditációval és imádsággal. 1550-ben Como városának inkvizítora lett, de idővel (1559-ben) Milánó és egész Lombardia főinkvizítorává vált. Hihetetlen lendülettel vetette magát a reformokba, és a rábízott területeken erős kézzel vetett véget minden eretnekségnek. Később IV. Piusz pápa Mondovi püspökévé nevezte ki, így Rómától távolabb került.
1566. január 6-án pápává választották, és az V. Piusz nevet vette fel. Piusz a megnövekedett napi teendők ellenére igyekezett megtartani szerzetesi szokásait. Ájtatos, erkölcsös életet élt, aki még a legsűrűbb napokon is legalább kétszer meditált és imádkozott. Térden állva könyörgött a katolikus egyház minden gondjának megoldásáért, és mindeközben nem vált meg a szerzetesi csuhájától sem. A domonkos szerzetesek fehér ruhájában jelent meg minden hivatalos eseményen, és csak tőle számítva lesz minden pápának fehér a ruhája.
Legfőbb célja volt, hogy a tridenti zsinat (1545-63) döntéseit és határozatait az egyház életében érvényre juttassa. A trónralépést követő rendeletek egymásutánja gyorsan megtisztította a pápai székvárost a legkirívóbb bűnöktől (prostítució és bikaviadalok betiltása, kocsmák, fogadók nyitvatartásáank szabályozása stb.). 1566-ban kiadta a zsinat által átdolgozott katekizmust, majd 1568-ban kiadta a Breviáriumot (Breviarium Romanum). 1570-ben megszületett a Missale, vagy más néven a Missa Tridentina, azaz Tridenti Mise. Pius ezt az új kiadást tette kötelezővé minden katolikus egyház számára, kivéve azokat, akik a misét az 1370-es évet megelőző rítusban tartották. Ez a hagyományos latin rítusként is ismert mise kisebb-nagyobb változtatásokkal még ma is érvényben van az 1970-ben megújított liturgia mellett, mint a római rítus rendkívüli formája.